WB检测


实验原理

 

Western Blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞或者组织样本中的蛋白,经转膜、封闭后目标蛋白与特有性一抗结合,再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的第二抗体起反应,经过底物显色,分析曝光条带的位置和灰度分析获知目标蛋白在样本中的表达情况(见图4.4)。该法结合了凝胶电泳和固相免疫测定两种技术的高特异性和高敏感性,可以对目标蛋白进行定型和半定量的分析。

 

图4.4Western Blot实验原理示意图

 

技术应用

 

通过抗原抗体反应对目标蛋白的表达进行半定量检测,还可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后续分析。WB作为一种方便可靠的研究工具,将与谱和蛋白质芯片等技术一起在蛋白质组时代发挥重要作用。

 

实验流程

 

实验结果展示

 

实物

数据信息

实验周期

客户提供

样本、抗体

抗体说明书

 

3周及以上

我们提供

剩余抗体

基本实验步骤、胶片结果、灰度分析结果





图4.5目标蛋白过表达上调的WB结果


图 4.6目标蛋白经RNAi下调的WB结果
 

TROUBLESHOOTING

 

实验问题

原因

推荐解决方法

未杂出目的条带

目的蛋白的表达量过低

提高上样量,浓缩目的蛋液,采用更高灵敏度的ECL发光试剂盒。

一抗或者二抗效价不足

使用新配制的一抗,避免反复冻融;增加一抗或者二抗浓度,适当延长孵育时间;若阳性对照未能杂出则需更换新的抗体。

二抗品种

二抗要针对一抗种属。

转膜效率低

选择合适的转膜方式,提高转膜效率。

背景过高

封闭条件不合适

延长封闭时间或更换封闭剂。

一抗/二抗浓度过高

降低一抗/二抗浓度并延长孵育时间。

抗体与封闭剂发生交叉反应

加温和去污剂如Tween20。

洗膜不足

可以增加洗膜次数。

 

 

 

非特异性条带

一抗质量不佳

更换其他来源一抗。

目的蛋白被修饰或降解,与目的蛋白有共同检测表位的剪切体或同一家族成员,目的蛋白可能形成多聚体

查找相关文献确认。

一抗或二抗浓度过高

条带弯曲不平整

电泳迁移速度过快或迁移温度过高

调整PH值、电压、电泳时降低环境温度。

 

常见问题 FAQ

 

Q:如何选择各个公司的抗体?

A:抗体可尽量选择进口原装抗体,如Abcam,CST,Santa cruz等公司的抗体。根据靶蛋白的种属(如人,小鼠,大鼠等)以及实验用途(WB,免疫组化,细胞免疫荧光等)在各个公司的网页上选择合适的抗体。选择抗体时务必注意核对基因NCBI的序列号,以防止因为基因的别名等原因导致买错抗体。另外再购买抗体时需注意是否提供完善的售后服务,在厂商规定的时间内未能得到预期的实验结果可将详细的实验信息交给抗体公司进行质量投诉,一般提供充分的实验数据并且在保质期内可以得到抗体调换等售后服务。

 

Q:抗体使用有哪些注意事项?

A:使用抗体前需仔细阅读说明书,了解抗体的保存条件以及不同用途下的推荐稀释比例。较高浓度的抗体(>0.5mg/mL)通常性质更稳定,受生产工艺和成本控制等因素影响,不同品牌的抗体的浓度也不相同,所以购买时应注意比较,经验不足的实验者往往被抗体的体积迷惑,要注意相同质量下低浓度的抗体体积反而更大。

 

Q:为什么各个抗体都要进行 WB预实验?

A:对WB结果有决定性影响的因素是抗体的效价和如果正确使用手中的抗体。正确使用抗体可以保证抗体效价不被过分的拮抗,与抗原更加有效的结合,从而获得特异性和非特异性背景之间差异的最大化。每一个抗体都有其特性,因此我们必须通过WB预实验获得背景小,非特异性条带少的实验结果。

预实验的内容如下:

1)确定一抗的稀释比例和孵育时间;

2)选择合适的封闭液及封闭时间;

3)调节合适的上样量,使内参条带灰度值趋于一致。

 

Q:半干转和湿转的优缺点有哪些?如何选择?

A:半干转和湿转两种转膜方式各有优劣。湿转适合所有的蛋白尤其分子量大的蛋白,转膜效率最佳,但对试剂消耗量较大,转膜时间长于半干转;半干转适合分子量小于100KD的蛋白,省时、省试剂。

 

Q:什么是WB的灰度半定量分析?

A:通常用Image J 或photoshop软件对各个样本的目的蛋白及其内参蛋白曝光后胶片的灰度值进行计算,按照灰度值的高低来半定量分析各个样品中蛋白的表达差异。

 

Q:WB进行几次重复实验?

A:我们常规报价的服务内容为进行预实验(摸索实验条件)并提供一次正式实验WB胶片结果。预实验一般会对封闭条件,抗体浓度,孵育时间等条件进行多次重复以获得一次最优的正式实验结果。客户若要求进行2-3次的生物学重复实验,请在签订合同前特别说明,我们会根据工作量的增加收取相应的费用。

 

参考文献

1. David Wild. The immunoassay handbook[M].Gulf Professional Publishing,2005.

2. John MW.Ehe Protein Protocols Handbook[M].Humana Press,2002.